### 培养条件

气相组成：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37℃。培养基：F12K + 10% FBS + 1% P/S。该细胞系源自一名58岁白人男性肺癌患者，通过DJGriad的肺癌组织移植建立。A549细胞能够通过胞苷二磷酸胆碱途径合成富含不饱和脂肪酸的卵磷脂。

### 传代方法

首次建议以1:2的比例进行传代。细胞培养的最佳做法是同时购买并使用完育产品，确保细胞状态良好。在收到细胞后，应处理并培养至良好状态，然后将完全培养液灌满并密封瓶口，这是运输细胞的最佳方式。

收到细胞后，请使用75%酒精对细胞瓶外表进行消毒，并在超净台内严格遵循无菌操作。将细胞瓶放置在37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，随后再进行处理。

进行显微镜观察以评估细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议分别拍摄40x、100x和200x），前三天的照片作为售后服务的重要依据，未提供照片默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

#### a. 细胞传代

如果细胞汇合度未超过80%，收集培养液至离心管中，保留5ml完全培养基并放入37℃、5% CO2孵箱培养；如果细胞密度超过80%，则可进行传代。以下为贴壁细胞的传代步骤：

1. 弃去培养上清，并用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲培养瓶后加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

#### b. 悬浮细胞传代

采用以下步骤进行细胞传代：

1. 使用半换液法处理。将培养瓶竖直放置在培养箱中静置约1小时，轻轻吸去3ml左右的培养基，补充3ml的完全培养基。如果培养基变色缓慢，可直接添加约500ul的FBS；传代时可直接补加5ml的培养基并分为两个培养瓶进行培养。通常情况下，经过3次传代后可进行一次离心传代以去除死细胞。
2. 如需进行离心换液法，则将细胞悬液收集到离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬均匀，再将细胞悬液按1:2的比例转移至新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的全新完全培养基，以保持细胞的生长活力。

### c. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清，添加1ml的尊龙凯时无菌冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存，若后期要将细胞转移至液氮罐中，则须在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐。

### d. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴保护面具），快速将其放置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放在37℃、5% CO2的培养箱中培养。
4. 第二天，换用新鲜的完全培养基继续培养。

### 注意事项

有些细胞在运输过程中可能会因贴壁不牢固而发生脱落，属于正常现象。如果细胞脱落较多，可将所有培养液收集至离心管中，1000 RPM离心5分钟，收集上清进行后续培养，沉淀部分可加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应。再次离心后弃去上清，再加入1-2ml完全培养基重悬。最后，按照1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），添加新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。