在现代生物医学研究中，蛋白质的一级结构——即氨基酸序列——已不再被视为简单的分子信息。它不仅决定了蛋白质的空间形状和功能特性，更深远地影响着细胞行为、信号传递、甚至与进化和疾病机制相关的过程。因此，获取蛋白质的精准序列成为深入理解其生物学功能和作用机制的基础。与传统的“蛋白鉴定”不同，蛋白测序专注于完整且连续的氨基酸信息，用于解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白一致性以及追踪翻译后修饰等关键研究任务。在生物药品开发、个性化医疗、结构生物学和抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精确性正日益成为研究和临床应用决策的重要技术支点。

一、蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学的研究中，“测序”和“鉴定”这两个术语常常被混用，导致术语误用、技术选择失误乃至研究假设混淆。蛋白测序是指对蛋白质进行氨基酸序列解析的过程，旨在重建其一级结构的完整顺序，通常从N端到C端展示氨基酸序列。其目标是获取“序列本体”，而不是简单判断蛋白的“存在性”或“分类”。相比之下，蛋白鉴定依靠质谱技术和数据库匹配，确定某个肽段是否归属于某个已知蛋白，这是一种分类性的“归属判断”，而不是真正的逐位点信息重建。

二、蛋白测序技术的发展

1. Edman降解：高精度线性识别的开端

Pehr Edman在20世纪50年代首次提出Edman降解法，成为蛋白质序列解析的早期化学实现。该方法利用苯异硫氰酸（PITC）对N端氨基酸的特异性反应，通过顺序标记与切除，每一轮循环中释放并鉴定一个PTH-氨基酸，从而实现线性序列重建。这种方法具有单个氨基酸级别的高识别精度，但也存在一些局限，如仅适用于具有游离N端的纯化样品，并通常不适合处理混合物或修饰蛋白。

2. Bottom-up质谱策略：高通量测序的核心

质谱技术的引入标志着蛋白测序发展的重要转折点。Bottom-up策略通过特定酶（如胰蛋白酶）将蛋白质酶解成短肽段，然后利用LC-MS/MS技术进行碎裂与检测，并借助数据库比对或de novo算法重建蛋白质序列。这一策略具备良好的通量和覆盖度，成为当前最广泛应用的蛋白测序方法。然而，由于它是一种间接的序列推导方式，存在序列上下文信息缺失等结构性限制。

3. Top-down质谱策略：整分子结构识别的深入发展

Top-down测序策略省略了酶解步骤，直接将完整蛋白质送入高分辨率质谱系统，通过高能碎裂技术解析其多级碎片离子，以实现对整个分子的一级结构解析。这一方法可在不破坏蛋白天然修饰组合的前提下，提供精确的序列与修饰定位信息，特别适合蛋白质翻译后修饰的识别和生物药质量属性的评估。

4. 单分子蛋白测序技术的崛起

传统质谱测序策略依赖于肽段的碎裂与谱图的重建，然而，近年来研究人员开始探索无需酶解、无需拼接技术的单分子蛋白测序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）。这一技术旨在在不破坏蛋白整体结构的基础上，实现对单一分子的逐残基识别，提供更为精确的序列信息。

随着蛋白测序技术不断演化，满足不同生物医学研究目标的需求变得愈加迫切。每种技术在实验策略、物理分辨率与数据模型之间需要进行平衡，从而为结构精确性、序列覆盖率及修饰还原度之间提供有效支持，为新药研发和质量控制等关键领域提供助力。

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